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                                                          質粒純化需要注意的要點有哪些呢?

                                                           更新時間:2024-02-29 點擊量:91

                                                          質粒是小的環狀超螺旋雙鏈 DNA,在宿主細胞內獨立于染色體外自主復制并穩定遺傳,可通過基因工程改造接入外源 DNA 作為基因載體,轉入宿主細胞。如今,質粒已成為生物制藥領域中最重要的工具之一,可用于克隆,擴增和表達目的蛋白;也可用于病毒載體和 mRNA 的生產等領域。質粒純化是大多數分子生物學實驗室的常用技術。雖然標準的堿裂解方法已經很成熟,但仍然可能出現令人驚訝的問題。那么,你知道質粒純化需要注意的要點有哪些呢?一起來探究一下吧!
                                                          忽略質粒的拷貝數
                                                          同一大腸桿菌母株的質粒產量可能因多種因素而有很大差異。然而,質粒的復制起點將發揮重要作用,因為它將決定每個大腸桿菌細胞的質??截悢?nbsp; 。因此,根據質粒的拷貝數,可能需要擴大質粒制備規?;蜻M行多次質粒制備,以獲得足夠的質粒DNA供下游應用使用。
                                                          忘記在培養物中添加抗生素
                                                          如果忘記在培養物中添加抗生素或添加太少,則可能導致質粒丟失。確保仔細檢查培養物中抗生素的濃度。
                                                          忽略透氣重要性
                                                          大腸桿菌培養物通常在瓶中生長,需要適當的通氣才能實現最佳生長。通常需要以 200-250rpm的速度搖動培養物。此外,考慮通過最小培養物與空氣體積比約為 1:5 來增加培養物通氣,使用棉塞或透氧膜等確保培養物獲得足夠的通氣。
                                                          過量培養
                                                          另一種情況是越多并不是越好,如果培養生長時間過長會導致基因組DNA污染。最好在接種后約 12-18 小時處理細胞。
                                                          測量OD600
                                                          OD600是估算培養物密度的好方法,以便您知道何時處理細胞。由于高光密度無法測量,因此取一份培養物,稀釋十倍并使用標準分光光度計進行測量。培養物已準備好以0.2-0.35的OD600處理十倍稀釋的培養物。
                                                          不要超出負載
                                                          許多質粒制備試劑盒都附帶有關培養條件的建議。請仔細遵循這些步驟,以確保裂解純化柱不會過載。添加過多的培養物肯定會降低裂解物的質量、堵塞純化柱并降低純化性能。
                                                          操作要清柔
                                                          正確純化質粒的關鍵之一是將基因組DNA與質粒DNA分離??梢酝ㄟ^移液或渦旋將細菌沉淀重懸于P1緩沖液中。然而,在裂解過程中不能過度混合,因為您可能會剪切基因組DNA,而基因組DNA會與柱基質結合并污染您的質粒。
                                                          忽略裂解時間
                                                          有些人可能認為裂解時間越長越好,然而大腸桿菌的堿裂解時間過長會產生大量非質粒碎片。此外,不同菌株的大腸桿菌對堿裂解的敏感性也不同。最重要的是,裂解時間過長可能會導致質粒 DNA 變性,從而導致制備質量差。
                                                          wan全中和裂解物
                                                          添加中和溶液并與裂解液混合后,不要立即進行下一步!中和不wan全可能導致制備質量差。確保多次翻轉試管以確保裂解物wan全中和。即使觀察到大的蓬松沉淀物,也需要多一點時間以確保溶液wan全混合。
                                                          防止細胞碎片雜質
                                                          中和步驟后,許多質粒制備物需要離心以將 DNA 與細胞碎片分離,從而澄清裂解物。在此步驟中,重要的是要緩慢進行,并避免將不必要的細胞碎片轉移到下一步,這可能會干擾結合和/或降低純度。
                                                          記得添加酒精
                                                          許多質粒制備試劑盒包含使用乙醇的洗滌緩沖液。這些緩沖液通常為濃縮液,使用前必須用乙醇稀釋。這是一個常見的錯誤,經常被遺忘并導致準備失敗。另外,不要忘記確保擰緊蓋子以防止乙醇蒸發。
                                                          P2加熱緩沖液
                                                          下游轉化問題的一個常見原因是鹽和蛋白質的污染。確保每次純化后測量A 260/A280和A260/A230比率,高于1.8的比率通常被認為是純凈且不含污染物的。
                                                          不要一次處理太多樣品
                                                          雖然可以最大限度地提高時間效率,但質粒純化中的某些步驟對時間敏感。不要嘗試一次處理太多樣本,否則某些準備工作可能會放置太久而失效。
                                                          不要忘記熱洗脫
                                                          如果質粒>10 kb,請考慮使用加熱至50°C的洗脫緩沖液,以提高從柱基質上洗脫的效率。此外,離心前可以將洗脫緩沖液留在柱上5-10分鐘。
                                                          以上就是小編總結的質粒純化需要注意的要點,如果你有更多補充請聯系北京百奧創新科技有限公司客服!

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